Investigación precisa el momento exacto en que el estrés de calor impacta con mayor fuerza en el maíz

Muchos de los nuevos bioestimulantes que salen al mercado buscan mejorar la resistencia de las plantas ante golpes de calor y el estrés que generan las altas temperaturas. No obstante, es clave saber cuándo y dónde aplicarlos para que logren su objetivo. En ese marco, el profesor Kevin Begcy, Ph.D., y su equipo de la Universidad de Florida están estudiando cómo los cultivos responden ante el estrés por calor.

Patricio Trebilcok y Francisco Fabres

Esto ha impulsado a los científicos a crear bioinsumos que aumenten la resistencia de las plantas ante las mayores temperaturas y los golpes de calor. No obstante, quienes desarrollan y aplican estas soluciones de origen biológico deben considerar que este estrés no afecta de igual manera a todo el desarrollo de la planta.  

Un fenómeno ampliamente reportado es el impacto del calor en la viabilidad del polen lo cual se traduce en menor rendimiento, lo que se ha visto en especias del género Brassica, en álamos, frejoles y el maíz.

Este último cereal fue el escogido  por el profesor Kevin Begcy, Ph.D., y su equipo de la Universidad de Florida para analizar cómo las altas temperaturas pueden impactar el desarrollo del polen. Esto, debido a su importancia como alimento, la disponibilidad de herramientas genéticas para hacer investigación con él, y la enorme cantidad de polen que produce, lo cual facilita mucho el trabajo de investigación.

Según el científico, los estudios realizados hasta ahora, han aplicado el estrés por calor durante todo el desarrollo del polen, de manera que no se sabe exactamente en qué momento provoca la inviabilidad. “En la práctica se asumiendo que habrá un efecto sobre el polen cualquiera sea el momento de ocurrencia del calor”, explica.

Profesor Kevin Begcy, de la Universidad de Florida

Pero el equipo de Kevin Begcy cuestionó que fuese así, por lo que trabajó buscó analizar el impacto en sus distintas fases antes de la germinación. Primero, en la fase de microsoporogénesis que es como se llama al paso de la célula madre del polen a una tétrada de cuatro microsporas, las cuales luego se liberan (en subetapas que se conocen como meiosito y tétrada, meiosis I y II). La segunda gran fase es la microgametogénesis, que es cuando esa espora liberada pasa a convertirse en polen maduro (unicelular, bicelular y tricelular, mitosis I y II). 

En la primera parte de su trabajo, los investigadores de la U. de la Florida debieron crear una metodología que les permitiera aislar una gran cantidad de polen en etapas específicas: tétrada, unicelular, bicelular y tricelular. Así, y efectuando análisis a nivel de bioquímica molecular, metabolómica e histología, se pudo determinar la respuesta de cada fase ante el aumento de temperatura, cuyos resultados fueron presentados en el Congreso Mundial de Bioestimulantes.

El tratamiento consistió en someter al polen a 35ºC por 48 horas, lo que se considera un estrés moderado a levemente alto.

Figura 1. Etapas de desarrollo del polen.

[De abajo hacia arriba:] Célula madre de polen; Pared callosa; Meiocitos; Núcleo diploide; Tétrada; Microsporas; Unicelular; Vacuola; Núcleo vegetativo; Bicelular; Célula generativa; Tricelular; Células espermáticas; Núcleo vegetativo; Germinación del polen; Almidón; Núcleo vegetativo; Células espermáticas.

Inicialmente, mediante tinción, se estableció que el almidón resulta afectado de manera importante por el estrés de calor, y esta macromolécula es vital porque aporta energía en la germinación. Otro hallazgo relevante fue detectar una degradación de la antera, estructura que contiene el polen y que permite su liberación, por lo cual sin duda el cambio provoca una diferencia en la llegada del polen al receptor femenino de la flor.

El calor en la etapa de tétrada:

MALFORMACIONES Y MENOR GERMINACIÓN

Begcy describe lo que sucedió cuando aplicaron el tratamiento de estrés exclusivamente en la fase de tétrada. Después de ser sometido a una alta temperatura, el polen sufrió malformaciones. Pero le pregunta es cuánto afecta esto a su rendimiento. A través de germinación in vitro se estableció que el polen no estresado germinó en más de un 80%, mientras el polen con estrés por calor germinó solo en algo más de 20%. Nuevamente surge una pregunta: dado que el maíz genera una enorme cantidad de polen, ¿sufrirá el rendimiento por esta reducción?

Antes de eso, Begcy y sus colaboradores habían llevado a cabo pruebas in vivo, depositando el polen sobre la espiga o inflorescencia femenina del maíz (sus “pelos” o “barba”). Se observó que el polen estresado veía dificultada su germinación, mientras que el polen sin estrés alcanzaba una completa formación de semillas en el raquis (“olote” o “coronta”, entre otras denominaciones).

Foto 1. Rendimiento de maíz fuertemente afectado debido a estrés por calor.

Al repetir el mismo experimento con polen estresado únicamente en la etapa de tétrada –que luego siguió su desarrollo sin ningún tipo de restricción–, usándolo para polinizar el lado femenino en plantas sin estrés, se observó una dramática baja de la germinación. Es posible inferir, en consecuencia, que esta etapa específica es sensible al estrés por aumento de temperatura.

LA BÚSQUEDA DE EXPLICACIONES MOLECULARES

Se buscó una explicación molecular de la causa. El análisis bioquímico comprobó una marcada reducción del almidón en el polen estresado respecto del normal. Además se usó la tintura diacetato de fluoresceína, que penetra la membrana celular y posibilita saber si el polen se encuentra metabólicamente activo. La conclusión fue que el almidón y también la actividad enzimática resultan perjudicados. A continuación se realizó un análisis transcriptómico con el fin principal de encontrar cuáles eran los genes importantes para la respuesta al estrés por calor. 

Como marcadores se usaron proteínas que responden al estrés por calor y se vio claramente que aun cuando la alta temperatura fue aplicada al inicio del desarrollo del polen, esas proteínas seguían activas en la madurez. Al hacer análisis de redes se encontraron quinasas –enzimas importantes en la fertilización– además de muchos otros genes que activan vías de respuesta a estreses. Llamaron la atención de los investigadores dos vías: la vía de la biosíntesis de energía y la vía de biosíntesis de lípidos.

La vía de la biosíntesis de energía parte de almidón y sacarosa, y ambas rutas pueden unirse para producir adenosín-5’-trifosfato –UTP (ATP, sigla en inglés), la principal molécula de almacenamiento y transferencia de energía en la célula– a través de piruvato o malato. La transcriptómica detectó que, ante estrés por calor, tres genes o enzimas de esta vía fueron regulados a la baja y dos al alza, quedando los demás inalterados. Dado que la transcriptómica no explicaba todo, se utilizó metabolómica. El resultado indicó que la glucosa y la fructosa se encontraban altas mientras el piruvato estaba bajo. En definitiva, los niveles de almidón eran escasos, porque la enzima capaz de convertir almidón en glucosa se encontraba regulada a la baja. Para compensar este déficit, básicamente la enzima invertasa asume el peso de la tarea convirtiendo sacarosa en fructosa y glucosa, manteniendo así la homeostasis en la producción de energía. Sin embargo más adelante en la ruta de biosíntesis de energía, otras dos enzimas reguladas a la baja probablemente actúan como cuello de botella, de manera que se observa una reducción en la producción de UTP.

EL ESTADO DE TÉTRADA ES AFECTADO A NIVEL TRANSCRIPTÓMICO Y METABOLÓMICO

En la vía de biosíntesis de lípidos mediante transcriptómica se encontraron dos enzimas reguladas al alza y una a la baja. Esta última es la que ayuda a convertir los compuestos de carbono a lípidos. La metabolómica determinó disminuciones de ácido pentadecílico, palmitoilo, ácido magárico y estearato. Se desprende entonces que el estrés por calor en el estado de tétrada afecta a nivel transcriptómico y también metabolómico.

“El modelo que proponemos –señala el académico– postula que, básicamente, cuando hay estrés por calor, se produce una disminución en almidón porque la UDP-glucosa pirofosforilasa es regulada a la baja. Así los pools de hexosa aumentan por acción de la invertasa, que trata de mantener en funcionamiento la glucólisis y producción de energía. Sin embargo, otras importantes enzimas se ven afectadas, y entonces hay una reducción en piruvato, lo cual impacta en la biosíntesis de energía, en los ácidos grasos y, finalmente, inciden sobre la germinación y dificultan la fertilización”.

EL POLEN EN ESTADO BICELULAR REACCIONA DE MANERA DIFERENTE ANTE EL CALOR

Hasta aquí no hay nada nuevo para los especialistas, subraya Begcy, “solo que encontramos las vías específicas que se ven afectadas”. Pero su equipo quiso seguir adelante y verificar si la ocurrencia de estrés por calor en otra etapa produciría el mismo efecto. Razonaban que el calor excesivo a nivel de campo no se presenta de manera constante, sino que hay picos de estrés, días más calientes que otros; luego las temperaturas bajan y eventualmente vuelven a subir.

El académico compartió los resultados de la etapa bicelular. Como en el caso anterior, se sometió al polen a 35ºC durante 48 horas únicamente en dicha fase. El polen tratado germinó sin problemas tanto in vivo como in vitro, al igual que lo hizo el polen no estresado.

Para comprobar que no se tratase de un error en la ejecución del experimento, el ensayo se repitió numerosas veces, con resultados similares. Sin embargo, se decidió estudiar con más detalle esta posible resiliencia del estado bicelular al estrés por calor. Se usaron distintos métodos de tinción e iluminación sin encontrar diferencias. No se hallaron variaciones significativas en la tasa ni en la velocidad de germinación, tampoco en la maduración del tubo polínico.

A este punto los investigadores ya pensaban que el estrés por calor no afecta en el estado bicelular, dado que no se apreciaba ningún cambio en los parámetros revisados. No obstante, al cruzar el polen que había sido estresado en la fase mencionada con raquis que no fueron sometidos a estrés, se detectó una disminución del rendimiento.

SI TODO EN EL POLEN PARECE BIEN, ¿POR QUÉ BAJA EL RENDIMIENTO?

¿Cómo explicar esta aparente anomalía? ¿A qué se debía el efecto negativo en la fertilización?

Nuevamente se despertó la curiosidad de los profesionales. Repitieron el procedimiento en múltiples oportunidades sin cambios en los resultados.

En el estado bicelular se encuentra una célula generativa y un núcleo vegetativo. Durante la transición a estado tricelular, ocurre la formación de células espermáticas. La célula generativa origina dos células espermáticas, las cuales, después de la fertilización, forman el embrión y de ahí el endosperma. Teniendo esto en cuenta, se planteó la hipótesis de que, si el impacto se daba sobre la fertilización y nada más, el problema podía deberse a algún defecto en las células espermáticas. Tal vez, especularon los investigadores, no se produce la transición de bicelular a tricelular: aunque el polen se desarrolla normalmente, la célula generativa no se divide.

Con el fin de testear la hipótesis, utilizaron un marcador de la célula espermática usando ingeniería genética (YPF, proteína amarilla fluorescente). Hubo una notoria diferencia en las imágenes fluorescentes de las células espermáticas de polen estresado y no estresado (foto2). Había un impacto, pero no total, ya que persistía una elongación. Repeticiones sucesivas dieron resultados similares.

Foto 2. El estrés por calor durante la etapa bicelular afecta a las células espermáticas.

NS: sin estrés por calor. HS: con estrés por calor en la etapa bicelular.

Cuando se probó la germinación, polen no sufrió estrés se desarrolló sin problemas en el tubo polínico, en tanto el que había sido estresado por calor no fue capaz de entregar las células espermáticas, las cuales no lograron salir del grano.

“La división estaba sucediendo, pero no existió una entrega de la carga: la información genética no viaja a través del esperma al tubo polínico. Esa fue la principal razón por la cual no se vió fertilización o esta se vió impactada –explica Kevin Begcy–. Un poco de polen que fue menos impactado debido al estrés por calor consiguió producir grano, sin embargo la mayoría resultó afectado”.

LOS SIGUIENTES AVANCES PERMITIRÁN CONOCER LA UTILIDAD DE LOS BIOESTIMULANTES

Posteriormente se han analizado células espermáticas mediante transcriptómica y proteómica (CRISPR/Cas9), y actualmente el equipo de científicos explora en detalle los genes responsables de la respuesta ante el estrés por calor, así como el motivo por el cual una parte del polen responde de manera distinta ante ese estímulo. La obtención de dichas informaciones hará posible saber si los bioestimulantes podrán ejercer alguna acción y tener control sobre ella.

En síntesis, Kevin Begcy indica los descubrimientos principales:

-El impacto del estrés por calor sobre el polen es diferente dependiendo del estado en que ocurre.

-El estado de tétrada es susceptible a un estrés por aumento transitorio de temperatura; la biosíntesis de energía y de lípidos son las dos vías afectadas principalmente.

-El estado bicelular no muestra alteraciones morfológicas después de un estrés por calor, no obstante, la fertilización sí se ve afectada, lo que podría deberse básicamente a que la carga de material genético no viaja hacia el tubo polínico.

Finalmente, el académico señaló que se está efectuando evaluaciones del estrés por calor sobre el óvulo, pero no en maíz, ya que resulta difícil hacerlo, sino en líneas de arroz adaptadas al clima del Sudeste Asiático. “Sorprendentemente la reducción no es tan dramática como en el caso del polen. Vemos que el componente femenino es un poco más resiliente”, dice.